一起学下一代测序技术（NGS）数据分析之数据质控

拿到基因测序公司的原始数据后，一般是clean data又称PF data，首先要做的就是查看数据量够不够以及测序的质量怎么样，目前最为流行的数据质量查看软件就是FastQC，今天我们来介绍一下该软件的用法。

首先安装FastQC，下载地址http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/download.html#fastqc：其实fastqc是免安装的，下载后解压缩，进入文件夹，输入命令chmod 755 fastqc，再运行。/fastqc就可以启动图文界面了，通过鼠标找到你的fastq文件，等待软件载入，结果分为如下几个部分

结果分为绿色的“PASS”，黄色的“WARN”和红色的“FAIL”。

1、Basic statistics

Total sequence代表reads数目，数据量等于reads数乘以每条reads的长度即41399965X125=5.2X109，即5.2G数据量

2、Per base sequence quality

quality就是Fred值，-10*log10（p），p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率为0.01时，其quality就是20。图像如上面例子，横轴代表位置，纵轴quality。红色表示中位数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间，蓝线是平均数。

若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报“WARN”；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报“FAIL”. 在测序早期经常会有不合格的测序reads，随着技术的发展，现在的测序质量已经非常高，以下为药明康德hiseq2500的数据质量，我们可以看到测序质量非常好。

3、Per Sequence Quality Scores

每条reads的quality的均值的分布，横轴为quality，纵轴是reads数目；

4、Per Base Sequence Content

对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基（正常情况）的分布，横轴为位置，纵轴为百分比。 正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias （建库过程或本身特点），或者是测序中的系统误差。

当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报“WARN”；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报“FAIL”。

5、Per Base GC Content

对所有reads的每个位置，统计GC含量，如果建库足够均匀，reads的每个位置应当是没有差异的，所以GC含量的线应当平行于X轴，反映样品（基因组、转录组等）的GC含量。当部分位置GC含量出现bias时，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时，往往代表文库有bias （建库过程或本身特点），或者是测序中的系统误差。当任一位置的GC含量偏离均值的5%时，报“WARN”；当任一位置的GC含量偏离均值的10%时，报“FAIL”

6、Per Sequence GC Content

统计reads的平均GC含量的分布，红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。

偏离理论分布的reads超过15%时，报“WARN”；偏离理论分布的reads超过30%时，报“FAIL”

7、Per Base N Content

当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”。对所有reads的每个位置，统计N的比率，正常情况下N的比例是很小的，所以图上常常看到一条直线，但放大Y轴之后会发现还是有N的存在，这不算问题。当Y轴在0%-100%的范围内也能看到“鼓包”时，说明测序系统出了问题。当任意位置的N的比例超过5%，报“WARN”；当任意位置的N的比例超过20%，报“FAIL”。

8、Sequence Length Distribution

reads长度的分布。当reads长度不一致时报“WARN”；当有长度为0的read时报“FAIL”

9、Duplicate Sequences

统计序列完全一样的reads的频率。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication），横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目，以unique reads的总数作为100%。 上图的情况中，相当于unique reads数目～10%的reads是观察到两个重复的，～2%是观察到三次重复的，依此类推。

可以想象，如果原始数据很大（事实往往如此），做这样的统计将非常慢，所以fastqc中用fq数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重复情况。大于75bp的reads只取50bp（不知道怎么选的）进行比较。但由于reads越长越不容易完全相同（由测序错误导致），所以其重复程度仍有可能被低估。

当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报“WARN”；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报“FAIL”。

备注：本文参考静渊的学习日志